组织培养的基本操作方法

实验室方面

　　①化学实验室：主要承担配制培养基的任务。要求具有各种化学药品试剂、各种玻璃器皿、称量天平等。

　　②洗涤室：主要进行玻璃器皿的洗涤，要求有自来水装置，同时有烘箱，以便洗后烘干。

　　③灭菌室：主要进行培养基和用具的消毒。要有高压灭菌锅，具有水源和电源。

　　④接种室：是花卉材料分离、消毒接种和转移的场所。要求密闭、清洁、整齐、装有紫外灯，能随时灭菌。有的也可用接种箱或超净工作台代替。

　　⑤培养室：是花卉材料培养生长的地方。要求清洁，保温好，室温均匀一致，并有绝热、防火性能。

　　设备方面

　　①天平：供配制培养基时称量药品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。

　　② 酸度计：测定培养基的pH用。

　　③高压灭菌锅：是供培养基和器械用具灭菌用。

　　④烘箱：洗净的玻璃器皿干燥灭菌用。

　　⑤蒸馏水制造装置：得到纯净水供培养用。

　　⑥冰箱：供贮放母液和植物材料用。

　　⑦接种箱或超净工作台：为植物材料接种或转移的操作场所。

　　⑧空调机：控制室温用。

　　3、花卉组织培养对培养基的要求

　　培养基是花卉植物组织培养中十分重要的基质，目前应用的有好多种，但其主要成分大体相同，主要成分是水，其他还有大量元素、微量元素、维生素、生长调节物质、蔗糖和琼脂等。

目前花卉组织培养中应用最多的为MS培养基。其组成是在配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1.65克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、钼酸钠0.25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖30克和琼脂7克。其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定。MS培养基中大量元素浓度过高，为此常采用1/2、1/4大量元素浓度作培养用，这样生长效果列好。

MS培养基配方
   
                  成分           分子量    使用浓度(mg/L)
大量元素 硝酸钾　KNO3    101.11    1900
         硝酸铵　NH4NO3   80.04    1650
     磷酸二氢钾　KH2PO4    136.09    170
       硫酸镁　MgSO4.7H2O  246.47   370
       氯化钙　CaCl2.2H2O   147.02    440
   
微量元素 碘化钾      　KI     166.01     0.83
         硼酸　       H3BO3   61.83     6.2
       硫酸锰　MnSO4.4H2O    223.01   22.3
       硫酸锌　ZnSO4.7 H2O   287.54    8.6
       钼酸钠　Na2MoO4.2 H2O 241.95   0.25
          硫酸铜　CuSO4.5 H2O 249.68   0.025
              氯化钴 CoCl2 62 237.93     0.025
   
铁盐 乙二胺四乙酸二钠　Na2.EDTA 372.25   37.3
 硫酸亚铁　FeSO4.7H2O 278.03            27.8
   
有机成分    肌醇                                100
            甘氨酸                                2
             盐酸硫胺素　VB1                   0.1
             盐酸吡哆醇　VB6                  0.5
                    烟酸　VB5或VPP           0.5
           蔗糖　sucrose 342.31                30g/L
                    琼脂　agar                  7 g/L

　　配制培养基前要准备好三角瓶、试管、烧杯、量筒、吸和等玻璃器皿，预先称好药品。配制时先将琼脂溶化，再加入在水中深解的各种营养元素和蔗糖，然后用氢氧化钠或盐酸调整培养基的pH，一般掌握在5.7左右。以后可分注到养瓶中，盖好瓶盖。培养基配好要经高压灭菌。冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，才可进行花卉材料的接种。

　　4、花卉组织培养的过程

　　花卉植物组织培养即无菌培养，也就是要求培养的材料不带有杂菌。从田间或温室等地切取花卉材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。

　　取来的材料虽经选择，外部总还有不少杂菌。为此，接种前应进行表面灭菌。通常先用自来水冲洗十几分钟，有泥的应刷去。冲洗干净后，用70%的酒精浸泡10-15秒钟消毒。接着用无菌水（经高压灭菌的蒸馏水）冲洗两次，再用10%的漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒，最后用无菌水冲洗3-4次。带有茸毛不易湿润消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆应在接种箱或超净工作台等无菌环境条件进行。经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉。再用解剖刀切取所需部位，通常几毫米大小，培育无病毒苗则应在1毫米以下，然后用解剖针或枪式镊子将材料接种到培养瓶上培养。工具用完即应在95%酒精中蘸一下，或用火焰消毒法消毒，避免工具带菌造成交叉污染。操作时应穿工作服、戴工作帽，事先洗净手，后再用酒精棉擦试一遍。

　　5、花卉组织培养材料的培养和移植

　　花卉材料接种后放到培养室培养。培养室是花卉材料培养生长的场所，一般几到十几平方米皆可。高度约2米左右，空间小，可节省控温能源。培养材料放在培养架上培养。培养架可有木材或金属制成，有4-5层，每层高40-50厘米，日光灯装在上方。架长1.2米左右，与40瓦日光灯长一致，宽80-90厘米。每一层可装两支日光灯，这样培养时的照度约为3000勒克斯。培养室的温度大多采取昼夜恒温培养，保持在25℃±2℃，也有采取昼夜变温培养的，夜晚温度可低些，这应根据花卉生长需

要而定。每天日光灯照明12-16小时。

　　花卉试管苗由于人工提供各方面优越条件，一般生长发育好，根系也多，可往往由于没掌握其特性，造成移栽时成活率不高。这是因为试管苗在瓶中湿度很高的条件下培养，人为提供蔗糖等碳源，花卉材料是处一起异养生活状态，可以说比温室生长的花卉还要娇嫩得多。而突然从瓶中移到土壤让其过自养生活，往往由于变化太剧烈而造成损伤甚至死亡。为此，花卉试管苗开始移出时，仍应罩上玻璃瓶，或盖上薄膜袋（上开几个小孔），1周后去掉。有喷雾条件则更理想。开始7-10天要遮荫，以后逐渐见阳光。移植基质以沙与蛭石各半为好，要排水、通风好，隔一天浇一次营养液。这样逐步锻炼，让其适应环境。2-3周后经驯化锻炼苗即可移至培养土中栽植。