菊花的组织培养方法

    菊花（Dendranthema morifolium）为多年生宿根花卉。观赏及栽培上，习惯把菊花的一个花序称为一朵花；从植物学角度，它是一个头状花序，由花序轴、总苞、边花及心花几部分组成[1]。菊花的组织培养主要用于新育成品种的快速繁殖，优良品种去除病毒和复壮。国内外对菊花的组织培养技术基本成熟，但在去除病毒和利用花瓣育种上，还需深入发展[2]。利用花瓣进行组织培养，其变异率要大于茎尖、腋芽等具有分生组织的外植体[3]，可作为新品种选育的辅助手段。菊花新育出的品种，基本都是花色的变异；菊花花色的突变规律为：粉色易变为黄色或白色，白色易变为黄色或粉色，黄色难变为其它颜色[1]。因此，此次实验选用传统双色品种“金背大红”作为组织培养的材料。

１　材料　

     选用“金背大红”品种，将其花蕾饱满、且包片未开裂的花蕾作表面消毒的材料，其中的花瓣作为诱导的外殖体。

２　实验方法

２．１　取材和消毒

　　取菊花未开放的花蕾，于自来水中荡洗１次，再用洗衣粉上清液荡洗和刷洗１次，自来水荡洗３次，放入已用洗衣粉水筛洗过的烧杯中，拿入无菌室；在超菌工作台上，用次氯酸钙浸泡８分钟，无菌水荡洗４次；再用０.1%的HgCl2溶液浸泡５分钟，无菌水荡洗６～８次。在无菌条件下，将材料放入无菌的培养皿中，用解剖刀将花蕾纵切成四块，剪去总花托（花序轴）和总苞，将分散的未开放的花瓣逐个接入以下（1）~（8）号培养基中。 每瓶接种花瓣3～5块。

２．２　培养条件 　

    培养基是以ＭＳ为基本培养基，附加不同激素构成。培养基：（1）MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；（2）MS+6-BA0.5mg/L+NAA2mg/L；                          （3）MS+6-BA0.5mg/L+IBA1mg/L； （4）MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L；                              （5）MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L； （6）MS+6-BA2mg/L+NAA2mg/L；                    （7）MS+6-BA2mg/L+NAA4mg/L； （8）MS+6-BA4mg/L+NAA0.5mg/L；                （9）MS + 6-BA2mg/L +NAA0.2mg/L；以上培养基琼脂浓度均为1%，蔗糖3%，PH5.8~6.0；高压灭菌锅中121℃温度下灭菌20分钟。培养温度23℃；采用全天光照，光照强度1000～1500lx。

３　 实验结果与讨论

３．１ 不同培养基条件下愈伤组织的生长

    将未展开的花瓣接入（1）～（8）号培养基中培养了11天后，各瓶中的小花瓣比原先增大了2至7倍；其中，（5）～（8）号培养基中的花瓣基部长出了淡黄绿色的愈伤组织。17天后，（1）～（4）号中的花瓣基部也长出了淡黄绿色的愈伤组织。20天后，各编号培养基中的愈伤组织生长情况如表1。
 
表1 愈伤组织生长情况
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培养基编号          1         2          3          4           5           6            7            8 
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长愈伤
组织的瓶数          2        10         3          10         10         10          10          10
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诱导率（％）      20      100       30        100       100       100        100         100
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     注：以上各编号培养基均接种10瓶。

    结论：愈伤组织都长在花瓣的基部，可能是所用的花瓣顶部太薄，不适于以上所用的培养条件；而花瓣的基部较厚，则可以脱分化，继而转变成愈伤组织。另外，还有可能是，在外植体消毒时，所使用的消毒方法使花瓣顶部受伤较大，至使细胞失去分化能力。从各瓶愈伤组织的生长情况来看，植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素。

３．２ 不同激素浓度对菊花花瓣的芽诱导

    诱导出愈伤组织后，继续让培养物在各自原来的培养基上继续分化。再过14天后，其生长情况如表2所示。

表2
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培养基编号            激素组合（mg/L）        根诱导瓶数（瓶）      芽诱导瓶数（瓶）
1                            6-BA0.5+NAA0.1                0                                 0
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2                            6-BA0.5+NAA2                   0                                 0
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3                            6-BA0.5+IBA1                    0                                 0
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4                            6-BA5+NAA0.2                   0                                 0
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5                           6-BA2+NAA0.5                    1                                 1
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6                            6-BA2+NAA2                      9                                 0
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7                            6-BA2+NAA4                      7                                 0
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8                            6-BA4+NAA0.5                   0                                 4
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     注：以上各编号培养基均接种仍然10瓶。

    其中（6）培养基中的培养物生根数最多，且根较粗，长度0.3~2.0cm,有细长的白色根毛。（7）号培养基中的培养物生根数不如（6）的多，其余特征与(6)无大区别。（8）号培养基中的培养物长出了芽，鲜绿色，最长的芽约3.5cm。此外，（5）号培养基有一瓶的花瓣基部诱导出根，另一瓶诱导出芽。此次诱导的芽及根都不得是在花瓣的基部。各编号培养基中的培养物的愈伤组织继续增长，且变绿。

    结论：通常情况下，高浓度的生长素和细胞分裂素都能抑制根的形成，生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成，比值小时促进不定芽的形成，比值处于中间水平时，则只长愈伤组织而不分化[4]。以上各浓度培养基中所出现的情况正符合这种规律。

３．３ 芽的继续分化培养

    将（5）~（8）号培养基中的培养物转接入（8）号培养基中进行分化培养。在转瓶过程中，保持培养物原来的极性。经15天后，各瓶情况如表3

表3   继续分化培养的芽诱导情况：
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提供培养物的
原培养基编号     （5）  （6）    （7）   （8）
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长芽瓶数（瓶）      3        5          0          1
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芽诱导率（％）      30      50        0          10
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注：各编号组接种10瓶

    其中，原编号（即提供培养物的原培养基编号）（8）的培养物只一瓶新分化出了芽，原先的芽密长成芽球，其芽数难以分辨清楚，见图1和图2。原（5）号和（6）号芽的分化情况较好。原（7）号培养物没有分化出芽，但有4瓶长根。此次计算的芽中，有一部分只见到一片小叶，有的有两片小叶，但不见其生长点。此外，除原（7）号的，其余各瓶中有一部分未分化芽的培养物的新长愈伤组织呈棘状凸起，有分化成小芽的趋势。

    结论：从继续分化的结果来看，首先用（5）号或（6）号培养基进行初步培养，再用（8）号培养基进行芽诱导，以这种方式来进行花瓣的芽诱导是比较成功的。

３．４ 芽的增殖培养（壮苗培养）

    将分化培养基中已分化出芽或小叶的培养物接种入（9）号培养基中。经过四天后，各瓶中的芽生长良好，叶色青绿，芽茎逐渐增粗，节间慢慢伸长，叶片增厚。

４　讨论

    在组织培养中，影响器官和体细胞胚形成的各种因素中，植物激数的影响是很显著的，特别是生长素和细胞分裂素。在一些情况中，所用激素的种类及浓度，调节着培养物再生的方式及器官分化的类型。如（6）号培养基中的培养物，原先是只生根的，转入（8）号培养基之后，就分化出了芽。当细胞分裂素的水平较高时，形成茎芽的数目可能较多，如原（8）号瓶中长成的牙球。芽和叶的形成及发育的解剖学过程与根发生早期是相同的，也就是说在原基形成前必须脱分化。一些研究者认为，当特定诱导处理而重新形成器官时，根和芽的原基在开始时可能是没有区别的[4]。因此，可用两步分化法进行芽诱导，即第一步诱导出原基，再选用不同激素的配比进一步诱导出芽。组织培养中芽的发育通常是有规则的，但是，有时也会出现极异常的结构，仅形成芽的类似物，或是叶的类似结构。

    根据对组织组织培养中根、芽器官形成的大量观察发现，组织培养中形成的芽在其基部很容易形成根。本次实验诱导出芽，并通过了壮苗阶段的培养，而生根诱导，进而移栽培养，选取观赏价值高的品种的这些步骤，有待以后的工作。