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菊花的组织培养方法

创建时间:2012-02-16

    菊花(Dendranthema morifolium)为多年生宿根花卉。观赏及栽培上,习惯把菊花的一个花序称为一朵花;从植物学角度,它是一个头状花序,由花序轴、总苞、边花及心花几部分组成[1]。菊花的组织培养主要用于新育成品种的快速繁殖,优良品种去除病毒和复壮。国内外对菊花的组织培养技术基本成熟,但在去除病毒和利用花瓣育种上,还需深入发展[2]。利用花瓣进行组织培养,其变异率要大于茎尖、腋芽等具有分生组织的外植体[3],可作为新品种选育的辅助手段。菊花新育出的品种,基本都是花色的变异;菊花花色的突变规律为:粉色易变为黄色或白色,白色易变为黄色或粉色,黄色难变为其它颜色[1]。因此,此次实验选用传统双色品种“金背大红”作为组织培养的材料。

1 材料 

     选用“金背大红”品种,将其花蕾饱满、且包片未开裂的花蕾作表面消毒的材料,其中的花瓣作为诱导的外殖体。

2 实验方法

2.1 取材和消毒

  取菊花未开放的花蕾,于自来水中荡洗1次,再用洗衣粉上清液荡洗和刷洗1次,自来水荡洗3次,放入已用洗衣粉水筛洗过的烧杯中,拿入无菌室;在超菌工作台上,用次氯酸钙浸泡8分钟,无菌水荡洗4次;再用0.1%的HgCl2溶液浸泡5分钟,无菌水荡洗6~8次。在无菌条件下,将材料放入无菌的培养皿中,用解剖刀将花蕾纵切成四块,剪去总花托(花序轴)和总苞,将分散的未开放的花瓣逐个接入以下(1)~(8)号培养基中。 每瓶接种花瓣3~5块。

2.2 培养条件  

    培养基是以MS为基本培养基,附加不同激素构成。培养基:(1)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L;(2)MS+6-BA0.5mg/L+NAA2mg/L;                          (3)MS+6-BA0.5mg/L+IBA1mg/L; (4)MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L;                              (5)MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L; (6)MS+6-BA2mg/L+NAA2mg/L;                    (7)MS+6-BA2mg/L+NAA4mg/L; (8)MS+6-BA4mg/L+NAA0.5mg/L;                (9)MS + 6-BA2mg/L +NAA0.2mg/L;以上培养基琼脂浓度均为1%,蔗糖3%,PH5.8~6.0;高压灭菌锅中121℃温度下灭菌20分钟。培养温度23℃;采用全天光照,光照强度1000~1500lx。

3  实验结果与讨论

3.1 不同培养基条件下愈伤组织的生长

    将未展开的花瓣接入(1)~(8)号培养基中培养了11天后,各瓶中的小花瓣比原先增大了2至7倍;其中,(5)~(8)号培养基中的花瓣基部长出了淡黄绿色的愈伤组织。17天后,(1)~(4)号中的花瓣基部也长出了淡黄绿色的愈伤组织。20天后,各编号培养基中的愈伤组织生长情况如表1。
 
表1 愈伤组织生长情况
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培养基编号          1         2          3          4           5           6            7            8 
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长愈伤
组织的瓶数          2        10         3          10         10         10          10          10
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诱导率(%)      20      100       30        100       100       100        100         100
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     注:以上各编号培养基均接种10瓶。

    结论:愈伤组织都长在花瓣的基部,可能是所用的花瓣顶部太薄,不适于以上所用的培养条件;而花瓣的基部较厚,则可以脱分化,继而转变成愈伤组织。另外,还有可能是,在外植体消毒时,所使用的消毒方法使花瓣顶部受伤较大,至使细胞失去分化能力。从各瓶愈伤组织的生长情况来看,植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素。

3.2 不同激素浓度对菊花花瓣的芽诱导

    诱导出愈伤组织后,继续让培养物在各自原来的培养基上继续分化。再过14天后,其生长情况如表2所示。

表2
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培养基编号            激素组合(mg/L)        根诱导瓶数(瓶)      芽诱导瓶数(瓶)
1                            6-BA0.5+NAA0.1                0                                 0
-------------------------------------------
2                            6-BA0.5+NAA2                   0                                 0
-------------------------------------------
3                            6-BA0.5+IBA1                    0                                 0
-------------------------------------------
4                            6-BA5+NAA0.2                   0                                 0
-------------------------------------------
5                           6-BA2+NAA0.5                    1                                 1
-------------------------------------------
6                            6-BA2+NAA2                      9                                 0
-------------------------------------------
7                            6-BA2+NAA4                      7                                 0
-------------------------------------------
8                            6-BA4+NAA0.5                   0                                 4
-------------------------------------------

     注:以上各编号培养基均接种仍然10瓶。

    其中(6)培养基中的培养物生根数最多,且根较粗,长度0.3~2.0cm,有细长的白色根毛。(7)号培养基中的培养物生根数不如(6)的多,其余特征与(6)无大区别。(8)号培养基中的培养物长出了芽,鲜绿色,最长的芽约3.5cm。此外,(5)号培养基有一瓶的花瓣基部诱导出根,另一瓶诱导出芽。此次诱导的芽及根都不得是在花瓣的基部。各编号培养基中的培养物的愈伤组织继续增长,且变绿。

    结论:通常情况下,高浓度的生长素和细胞分裂素都能抑制根的形成,生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成,比值小时促进不定芽的形成,比值处于中间水平时,则只长愈伤组织而不分化[4]。以上各浓度培养基中所出现的情况正符合这种规律。

3.3 芽的继续分化培养

    将(5)~(8)号培养基中的培养物转接入(8)号培养基中进行分化培养。在转瓶过程中,保持培养物原来的极性。经15天后,各瓶情况如表3

表3   继续分化培养的芽诱导情况:
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提供培养物的
原培养基编号     (5)  (6)    (7)   (8)
-------------------------------------------
长芽瓶数(瓶)      3        5          0          1
-------------------------------------------
芽诱导率(%)      30      50        0          10
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注:各编号组接种10瓶

    其中,原编号(即提供培养物的原培养基编号)(8)的培养物只一瓶新分化出了芽,原先的芽密长成芽球,其芽数难以分辨清楚,见图1和图2。原(5)号和(6)号芽的分化情况较好。原(7)号培养物没有分化出芽,但有4瓶长根。此次计算的芽中,有一部分只见到一片小叶,有的有两片小叶,但不见其生长点。此外,除原(7)号的,其余各瓶中有一部分未分化芽的培养物的新长愈伤组织呈棘状凸起,有分化成小芽的趋势。

    结论:从继续分化的结果来看,首先用(5)号或(6)号培养基进行初步培养,再用(8)号培养基进行芽诱导,以这种方式来进行花瓣的芽诱导是比较成功的。

3.4 芽的增殖培养(壮苗培养)

    将分化培养基中已分化出芽或小叶的培养物接种入(9)号培养基中。经过四天后,各瓶中的芽生长良好,叶色青绿,芽茎逐渐增粗,节间慢慢伸长,叶片增厚。

4 讨论

    在组织培养中,影响器官和体细胞胚形成的各种因素中,植物激数的影响是很显著的,特别是生长素和细胞分裂素。在一些情况中,所用激素的种类及浓度,调节着培养物再生的方式及器官分化的类型。如(6)号培养基中的培养物,原先是只生根的,转入(8)号培养基之后,就分化出了芽。当细胞分裂素的水平较高时,形成茎芽的数目可能较多,如原(8)号瓶中长成的牙球。芽和叶的形成及发育的解剖学过程与根发生早期是相同的,也就是说在原基形成前必须脱分化。一些研究者认为,当特定诱导处理而重新形成器官时,根和芽的原基在开始时可能是没有区别的[4]。因此,可用两步分化法进行芽诱导,即第一步诱导出原基,再选用不同激素的配比进一步诱导出芽。组织培养中芽的发育通常是有规则的,但是,有时也会出现极异常的结构,仅形成芽的类似物,或是叶的类似结构。

    根据对组织组织培养中根、芽器官形成的大量观察发现,组织培养中形成的芽在其基部很容易形成根。本次实验诱导出芽,并通过了壮苗阶段的培养,而生根诱导,进而移栽培养,选取观赏价值高的品种的这些步骤,有待以后的工作。

 

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